Badania markerów genetycznych

Kamila Żuchowska

Badania markerów genetycznych stanowią gwarancję tożsamości osobnika oraz są wymagane w wielu przypadkach określonych w przepisach i programach hodowlanych koni poszczególnych ras. Postaramy się przybliżyć, w jakim celu badania te są wykonywane, jakich formalności należy dopełnić oraz – na wstępie – czym tak właściwie są markery genetyczne.

Markery genetyczne są to cechy jakościowe, specyficzne dla każdego osobnika, uwarunkowane w sposób prosty. Są dziedziczne oraz nie zmieniają się w ciągu całego życia zwierzęcia. Aby marker genetyczny był przydatny do analizy, musi być polimorficzny. Dzieje się tak, gdy w populacji występują minimum dwa allele w locus danego markera. Dzielimy je na dwie klasy. Do klasy I zalicza się sekwencje kodujące, czyli geny. Są to antygeny krwinkowe (grupy krwi) oraz polimorficzne białka i enzymy krwi. Do klasy II zaliczamy niekodujące sekwencje mikrosatelitarne. Markery mogą być badane metodami serologicznymi, wymagającymi zastosowania surowic testowych (grupy krwi) lub przez elektroforezę – technikę analityczną, której istotą jest rozdzielanie białek oraz fragmentów DNA przez wymuszenie wędrówki ich cząsteczek w polu elektrycznym. Wynik badania otrzymuje się w postaci słupka poziomych prążków, znajdującego się na żelu elektroforetycznym. Chcąc się dowiedzieć, czy dany osobnik może pochodzić po wskazanej parze rodzicielskiej, musimy porównać obraz prążków potomka z obrazem prążków matki i ojca (warunek – rodzice muszą mieć zbadane DNA, a nie tylko grupy krwi i białka). Należy pamiętać, że każdy z prążków analizowanego osobnika powinien pochodzić od jego matki lub ojca – czyli na obrazie znajdować się na tej samej wysokości co prążek badanego konia. Jeżeli wśród prążków potomka występują takie, które nie pasują do żadnego z prążków rodziców, wyklucza się pochodzenie po wskazanej parze rodzicielskiej.

Po co są badania markerów genetycznych?

Weryfikacja pochodzenia jest niezbędnym elementem prowadzenia rzetelnej oraz świadomej hodowli. Właściwa identyfikacja zwierząt jest zasadniczym warunkiem prawidłowo realizowanych programów hodowlanych.
Badania markerów genetycznych są obligatoryjne dla źrebiąt urodzonych w wyniku inseminacji, klaczy i ogierów wpisywanych do ksiąg głównych, ogierów kwalifikowanych do zakładów treningowych oraz koni sprowadzanych z zagranicy używanych w rozrodzie w Polsce. Jeśli koń był badany w kraju pochodzenia, wymagany jest certyfikat pochodzenia, w wypadku ogierów potwierdzający pochodzenie po obojgu rodzicach, natomiast w przypadku klaczy potwierdzający pochodzenie po ojcu. Do końca 2013 r. obligatoryjne były także badania koni ras zachowawczych – źrebiąt koników polskich i hucułów – przed wydaniem paszportu.
W wypadku ogierów obowiązkowe jest potwierdzanie pochodzenia po obojgu rodzicach, sam profil genetyczny konia nie jest wystarczający. Należy również zaznaczyć, że w wypadku badań koni starszych analizowanymi markerami były grupy krwi i białka, a nie DNA. Badania markerów stanowią możliwość wychwytywania błędów, powstałych w wyniku takich zdarzeń, jak np. niekontrolowany skok młodego ogierka na pastwisku, pomylone źrebięta w stadzie, błędy popełniane w dokumentacji przez osoby prowadzące punkty kopulacyjne czy inne, wynikające z ludzkiej pomyłki, które negatywnie odbijają się na efektach pracy hodowlanej. Błędy te w ogóle nie powinny pojawiać się u zwierząt będących przedmiotem oceny wartości hodowlanej, selekcji oraz doboru do kojarzeń, a także przedmiotem transakcji krajowych i międzynarodowych, opiewających niekiedy na wysokie kwoty. W celu wyeliminowania skutków takich nieprawidłowości niezbędne jest potwierdzanie pochodzenia koni.

Badania dotacyjne

Polski Związek Hodowców Koni od 2007 r. dofinansowuje badania markerów genetycznych, przeznaczając niebagatelną kwotę co najmniej 550 tys. zł. rocznie na wsparcie finansowe dla hodowców. Dotyczy to weryfikacji pochodzenia koni wpisywanych do księgi głównej, dla których PZHK prowadzi księgi stadne, oraz źrebiąt koników polskich i hucułów urodzonych do końca 2013 r. Obecnie dla koni tych ras obligatoryjne będzie badanie DNA dopiero w momencie wpisu do księgi, tak jak koni pozostałych ras. Od roku 2014 PZHK podjął się dofinansowania badań DNA ogierów starszych, posiadających licencję oraz potomstwo hodowlane, dla których w momencie wpisu do księgi zostały określone markery genetyczne I klasy. Analogicznie w kolejnych latach, o ile będą na to środki, planowane jest wykonanie badań DNA klaczy wpisanych do ksiąg.

Badania ogierów starszych

Celem tego przedsięwzięcia jest uzupełnienie w pierwszej kolejności puli wyników badań ogierów posiadających licencję, a mających zbadane jedynie markery I klasy. Należy wspomnieć, że przez lata badanymi markerami były grupy krwi i białka. Dopiero od 2007 r. analizowane jest DNA koni przy równoległym, dodatkowym badaniu markerów I klasy, którego wynik służy do porównania wyników potomka i jego rodziców, którzy nie mieli wcześniej zbadanego DNA.
Po wykonaniu badań DNA całej populacji koni czynnych w rozrodzie (klaczy i ogierów) przy badaniu kolejnych pokoleń kwalifikowanych do hodowli możliwe będzie odejście od przesyłania do laboratorium próbek krwi. Możliwe będzie wówczas badanie DNA z próbek włosów wraz z cebulkami, które tak jak w wypadku badania DNA z krwi, daje 99,99 % pewności potwierdzenia pochodzenia po wskazanej parze rodzicielskiej. W celu przyspieszenia tego procesu obecnie dla każdego badanego konia wykonywane są badania markerów I i II klasy. Przesyłanie w przyszłości samych włosów wraz z cebulkami usprawni weryfikację pochodzenia oraz zmniejszy koszty związane z badaniem.

Weryfikacja pochodzenia z próbki włosów

W sytuacji kiedy tylko część populacji koni czynnych w hodowli ma zbadane markery II klasy (DNA), może nie być możliwa weryfikacja pochodzenia osobnika, którego próbka włosów trafiła do laboratorium, a którego rodzice mają określone jedynie grupy krwi i białka. Nie będzie możliwe porównanie posiadanej na tej podstawie informacji genetycznej, ponieważ potomek będzie miał określone niekodujące sekwencje DNA, podczas gdy dla jego potencjalnych rodziców określono jedynie grupy krwi i białka, których z kolei nie można określić, posiadając cebulki włosowe. Dlatego tak istotne jest zebranie badań DNA wszystkich koni hodowlanych, żeby możliwa była weryfikacja pochodzenia nowo badanych koni na podstawie posiadanych wyników ich rodziców, bez konieczności przesyłania próbek krwi, tak jak to się dzieje dotychczas. Należy zaznaczyć, że pula koni, którym należy w tym celu uzupełnić wyniki badań DNA, jest bardzo duża i przedsięwzięcie to wymaga zaangażowania oraz współpracy PZHK z laboratoriami, okręgowymi i wojewódzkimi związkami oraz właścicielami badanych koni w celu szybkiej i rzetelnej realizacji tego trudnego, aczkolwiek bardzo ważnego zadania. Chcielibyśmy szczególnie poprosić wszystkich hodowców oraz właścicieli badanych koni o współpracę.

Dlaczego nie pozostać przy badaniu grup krwi i białek?

W latach 60. XX w. opracowano metody badania pochodzenia koni przez stworzenie antygenów i surowic to umożliwiających. Wraz z rozwojem nauki oraz dzięki nowym metodom badawczym możliwe stało się określanie pochodzenia koni na podstawie sekwencji mikrosatelitarnych w łańcuchu DNA. Badanie grup krwi i białek umożliwia potwierdzenie pochodzenia w 95-97 %, natomiast badanie sekwencji DNA przy obecnych metodach i aparaturze laboratoryjnej daje 99,99 % pewności, że dany osobnik pochodzi po wskazanej parze rodzicielskiej. Stąd przewaga badań DNA nad określaniem grup krwi i białek w celu weryfikacji pochodzenia koni.

Co należy zrobić?

Pierwszą czynnością, jaką powinien zrealizować właściciel konia, aby wykonać badanie markerów genetycznych, jest zgłoszenie się do okręgowego / wojewódzkiego ZHK w celu otrzymania protokołu pobrania krwi (dotacyjny lub niedotacyjny) oraz dwóch plastikowych probówek z korkami oraz miejscem na wpisanie nazwy konia (bardzo istotne, gdy w kopercie znajdują się próbki krwi kilku koni). Jedna z próbówek zawiera granulki aglutynacyjne, natomiast druga antykoagulant. Wiek badanego konia powinien wynosić minimum miesiąc. Każdą próbówkę należy uzupełnić pobraną krwią do pełna. Należy przechowywać je w temperaturze od +4 do +19°C. Krew powinna trafić do laboratorium nie później niż 48 godzin od momentu pobrania. Dostarczenie przesyłki w takim czasie możliwe jest przez wysyłkę zwykłego listu priorytetowego (uwaga – nie poleconego) lub kurierem. Jeśli krew zostanie wysłana od razu po pobraniu, w zupełności wystarczy list priorytetowy, najlepiej w tzw. kopercie bąbelkowej. Jest to rozwiązanie korzystne ekonomicznie dla hodowcy. Niedopuszczalne jest zamrażanie, trzymanie w wysokich temperaturach oraz dłuższe przechowywanie pobranej krwi przed wysyłką (stanie się bezużyteczna). Zaleca się pobieranie krwi oraz wysyłkę od poniedziałku do środy, tak by próbka dotarła do laboratorium w dni robocze, najpóźniej do piątku. Jeśli krew zostanie przechowana na poczcie do poniedziałku następnego tygodnia, nie będzie nadawała się do analizy. Mając próbówki, protokół oraz informacje o terminie dosyłania próbówek, należy umówić wizytę uprawnionej osoby, która pobierze krew (lekarz lub technik weterynarii).
Zdecydowanie łatwiejsze jest pobranie próbki włosów. W celu usunięcia zanieczyszczeń i uszkodzonych włosów należy przeczesać grzywę lub ogon (zaleca się pobieranie próby włosów z grzywy), następnie trzeba uchwycić 10-20 włosów i energicznie wyrwać. Zbyt długie włosy należy przyciąć na długość ok. 10 cm. Wysyłana próbka powinna zawierać ok. 30-40 włosów wraz z cebulkami (włosy bez cebulek są bezużyteczne). W razie wysyłki próbek włosów kilku koni poszczególne komplety należy oddzielić od siebie (np. umieścić w osobnych torebkach lub mniejszych kopertach), żeby nie pomieszały się podczas transportu w kopercie zbiorczej. Każdy komplet powinien być opisany nazwą konia, np. na dołączonej kartce.
Do każdej próbki (krew lub włosy) należy dołączyć „Protokół pobrania krwi od konia” oraz „Zlecenie badania DNA u konia” (druki dostępne na stronie obydwu laboratoriów). W wypadku koni objętych dotacją PZHK właściciel przesyła tylko dotacyjny „Protokół pobrania krwi od konia”, który musi być podpisany przez właściciela, osobę pobierającą krew oraz pracownika okręgowego/wojewódzkiego ZHK. Przy braku podpisów laboratorium odeśle dokument w celu jego uzupełnienia, co wydłuży całą procedurę. Przypominamy zatem o konieczności wysyłki podpisanych protokołów.

Koszty

Badania DNA koni wpisywanych do ksiąg głównych finansowane są przez Polski Związek Hodowców Koni. W pozostałych przypadkach koszty badań ponoszą właściciele koni. Jednostkowy koszt badania DNA w obu laboratoriach wynosi obecnie 160 zł. Sprowadzenie certyfikatu pochodzenia ogiera z zagranicy kosztuje 50 zł. Zajmuje się tym odpowiednie laboratorium, do którego właściciel zwróci się o sprowadzenie certyfikatu.

Gdzie wysłać próbki?

W Polsce badaniami markerów genetycznych koni, dla których PZHK prowadzi księgi stadne, zajmują się Laboratorium Badań Markerów Genetycznych u Koni Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu oraz Laboratorium Badania Grup Krwi – Zakład Doświadczalny Instytutu Zootechniki w Chorzelowie. Dane kontaktowe dostępne są na stronie internetowej PZHK, w zakładce Hodowla – Genetyczna kontrola pochodzenia koni.

Koniki polskie i hucuły

Mimo że od 2014 roku badania DNA źrebiąt hucułów i koników polskich nie są dotowane, zachęcamy wszystkich hodowców koni tych ras do kontynuowania wykonywania badań źrebiąt, żeby uniknąć ewentualnych pomyłek w identyfikacji. W sytuacji kiedy konie – zarówno dorosłe, jak i źrebięta – są do siebie bardzo podobne (ta sama maść, brak odmian) oraz przy tabunowym systemie utrzymania mogą zdarzyć się błędy w identyfikacji osobnika.
Obecnie obligatoryjne jest badanie koników polskich i hucułów przed wpisem do księgi. Jednak do tego momentu generowane są duże koszty związane utrzymaniem oraz pielęgnacją koni i istotne jest, aby po trzech latach pracy hodowcy nie okazało się, że przy badaniu przed wpisem do księgi pochodzenie się nie potwierdzi. W takiej sytuacji koń otrzyma dokument zastępczy bez prawa wpisu do księgi, bez pochodzenia, co wyklucza go jako konia hodowlanego oraz znacząco zmniejsza realną cenę, którą hodowca będzie mógł uzyskać w momencie sprzedaży. Gorąco zachęcamy zatem wszystkich hodowców koników polskich i hucułów do kontynuowania wykonywania badań DNA dla źrebiąt koni tych ras w celu wyeliminowania ewentualnych pomyłek i związanych z tym utrudnień, co jest szczególnie ważne przy specyfice hodowli i utrzymywania koników polskich i hucułów oraz możliwego ich uczestnictwa w programach ochrony.